La contaminación ambiental en las ciudades urbanizadas es un grave problema ocasionado por el estilo de vida moderno. El daño causado por los contaminantes tiene repercusiones en nuestro organismo a nivel molecular y celular, específicamente afecta el material genético, el ADN (ácido desoxirribonucleico), el cual es indispensable para el correcto funcionamiento de las células. Un gran porcentaje de estos daños serán reparados en su totalidad por diversos mecanismos de defensa que posee nuestro cuerpo, pero desafortunadamente alrededor del 0.02% de los daños serán permanentes y podrán desencadenar en el desarrollo de diversas patologías, incluyendo enfermedades respiratorias, cardiovasculares, neurodegenerativas e incluso cáncer. ¿Pero qué técnicas de laboratorio podemos utilizar para evaluar el efecto que los contaminantes ambientales tienen en la salud y en la calidad de vida de la población en las grandes ciudades?
Ciertamente, las técnicas de biología molecular serán fundamentales para lograr el objetivo, ya que estas se utilizan para estudiar el ADN, permitiendo obtenerlo, visualizarlo, cortarlo, pegarlo, e incluso amplificarlo para hacer millones de copias de la región de interés para su posterior estudio (Figura 1).
Figura 1. Esquema gráfico sobre el objetivo, equipo y técnica de los pasos de obtención, amplificación y visualización del ADN.
Obtención del ADN
Para estudiar el ADN, el primer paso indispensable es su obtención. Para esto es necesario aislarlo y purificarlo a partir de cualquier tejido. Usualmente la sangre es la fuente más sencilla para la obtención y dependiendo de la cantidad de muestra que se requiera, una simple gota de sangre proveniente de un pinchazo puede ser suficiente o en caso de ser necesaria mayores cantidades, se podría requerir de una toma de muestra de sangre para obtener varios mililitros. Después de la obtención de la sangre, se requiere separar las células blancas mediante un gradiente de densidad , para posteriormente realizar una serie de lavados y agregar enzimas llamadas proteinasas, las cuales ayudarán a eliminar las proteínas del medio, así como también la adición de detergentes para eliminar las membranas plasmáticas e ir purificando el ADN de la mezcla.
Amplificación del ADN
Probablemente en este punto tengamos poca cantidad de ADN para poder realizar otra serie de estudios, por lo que pudiera ser útil recurrir a la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa, por sus siglas en inglés) para amplificar una región específica del ADN y obtener millones de copias del ADN en cuestión de horas. Para realizar la técnica, los siguientes componentes se colocan en un tubo de PCR:
- Muestra de ADN a amplificar
- Nucleótidos, los cuales son la pieza básica del ADN y están formados por un azúcar un fosfato y la base nitrogenada
- Iniciador o primer, el cual es la secuencia corta de ADN que fue diseñada específicamente para la región de interés que se desea copiar y que sirve como punto de partida para la replicación
- Taq polimerasa es una enzima termoestable y quien es la responsable de replicar el fragmento de ADN de interés
- Buffer que aportará las condiciones ideales para llevar a cabo la replicación del ADN.
- Posteriormente, el tubo de PCR se coloca dentro del termociclador, el cual es el equipo donde se lleva a cabo la síntesis del ADN y que es el responsable de llevar a cabo los diferentes ciclos de calentamiento y enfriamiento necesarios en el proceso de replicación.
El primer paso es la desnaturalización, la cual ocurre a 96°C e implica que la reacción se calienta para separar las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. El segundo paso es el alineamiento, el cual ocurre de 55 a 65°C y permite que la reacción se enfríe para que los primers se unan a su complemento en el molde de ADN de cadena sencilla. El último paso es la extensión, esto ocurre a 72°C para que la Taq polimerasa extienda los primers y sintetice las nuevas cadenas de ADN.
El nuevo ADN que se produce en una ronda será utilizado como molde en el siguiente ciclo de síntesis de ADN, por lo que la producción de ADN se realiza exponencialmente. Los pasos anteriormente descritos se repiten entre 25 a 35 veces, lo cual tarda entre 2 a 4 horas y permite producir miles de millones de copias del ADN.
Visualización del ADN
Finalmente, para poder visualizar el producto de la técnica de PCR se emplea la electroforesis utilizando gel de agarosa. Esta técnica molecular permite la migración del ADN explotando su tamaño y carga al aplicar una corriente eléctrica. Lo primero es preparar el gel de agarosa, el cual contendrá una serie de pocillos en uno de los extremos para poder colocar dentro de cada uno la muestra de ADN que se desea visualizar. Posteriormente se vierte el buffer de corrida, el cual es una solución tampón conductor que ayudará a pasar la corriente eléctrica. Al encender la fuente de poder, la corriente eléctrica ayudará al ADN a moverse hacia el polo positivo, ya que el ADN tiene una carga negativa. Adicionalmente, el gel de agarosa actuará como una especie de malla que facilitará el paso de las moléculas de menor tamaño, las cuales recorrerán el gel y llegarán al otro extremo, mientras que las moléculas grandes permanecerán cerca del pocillo donde se cargaron. Al finalizar la corrida de electroforesis, el gel debe ser teñido con un colorante que permita la visualización del ADN.
En conclusión, estas tres técnicas básicas de biología molecular servirán para obtener cantidades suficientes de ADN y poder hacer su visualización en geles de agarosa. Posteriormente, se podrá emplear el uso de otras técnicas más específicas como por ejemplo la técnica de ensayo cometa para estudiar daño al ADN en células individuales ocasionado por la exposición a agentes genotóxicos.
Referencias:
1. DeMarini DM, Claxton LD: Outdoor air pollution and DNA damage. Occupational and environmental medicine 2006, 63(4):227-229.
2. Bartee L, Shriner W, Creech C: Principles of Biology: Biology 211, 212, and 213: Open Oregon Educational Resources; 2017.
Acerca de nuestra divulgadora invitada: Mirna González-González es Profesora Investigadora de la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del Tecnológico de Monterrey, donde además de otras funciones, imparte los módulos prácticos del Bloque de Mecanismos Celulares y Moleculares para compartir su pasión por la investigación con los alumnos de primer semestre.
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Esta entrada es el resultado del taller Escribir para divulgar, donde los participantes han empezado a desarrollar habilidades de escritura, para compartir eso que saben o que les gusta acerca de la ciencia y la tecnología.
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